甲基化修饰（甲基化修饰与支气管哮喘的研究进展）

中南大学湘雅医学院附属株洲医院呼吸与危重症医学科 412000

通信作者：刘毅

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摘要

支气管哮喘(哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病，遗传、环境及免疫因素均参与其发病，表观遗传学充当媒介将三者联系起来，影响哮喘的发生、发展。甲基化修饰作为哮喘中常见的表观遗传学修饰，能通过不同机制参与哮喘的发病。本文回顾性分析近年相关文献，主要从作用机制及潜在治疗方面，阐述甲基化修饰与哮喘的关系。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是哮喘中最常见且较稳定的一种表观遗传学修饰，多发生在位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)处，由DNA甲基转移酶催化[1]，基因启动子内的CpG岛高甲基化导致基因转录沉默，而低甲基化则促进转录的发生。研究发现哮喘中许多基因有DNA甲基化特征，并可以通过影响CD4＋T细胞分化、气道炎症、气道重塑及气道高反应性参与哮喘发病。

1.1 参与CD4＋T细胞分化

CD4＋T淋巴细胞是哮喘发生、发展过程中最重要的调控者，在不同的条件下，可以进一步分化为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)。近年来根据哮喘的免疫反应类型，可划分为Th2型哮喘和非Th2型哮喘，Th2型哮喘主要表现为：过敏性、嗜酸粒细胞浸润为主，对糖皮质激素治疗敏感；非Th2型哮喘中以Th17细胞免疫应答为主的，往往易进展为中性粒细胞浸润为主的重症哮喘，对糖皮质激素治疗不敏感[2]。初始CD4＋T细胞具有可塑性，DNA甲基化能通过诱导CD4＋T细胞向不同Th型分化[3]，导致不同类型的哮喘。(1)Th2型哮喘的主要发病机制为Th1/Th2平衡向Th2偏移，干扰素γ及IL-4是初始CD4＋T细胞分化为Th1及Th2细胞的重要细胞因子，初始CD4＋T细胞IL-4及干扰素γ基因启动子区域CpG岛甲基化水平均高，在受变应原刺激后的哮喘患者中发现：IL-4启动子区域去甲基化，反向调节γ干扰素启动子区高甲基化，从而促使CD4＋T细胞向Th2型分化[4]；同时在卵清蛋白致敏的哮喘小鼠模型中，也发现CD4＋T细胞的γ干扰素基因启动子区域甲基化水平增高，IL-13甲基化水平降低，促进Th2分化[5]。另外，前列腺素D2受体基因[6]、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域受体基因[7]、Notch1启动子区域的低甲基化[8]，及信号转导与转录激活因子5a[9]、Runt相关转录因子3的高甲基化[10,11]，在参与哮喘的T细胞分化、Th1/Th2细胞平衡、嗜酸粒细胞浸润的炎症反应中也发挥重要作用。(2)Th17是参与重症哮喘发病的重要细胞，细胞因子信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)能抑制Th17分化，甲基化CpG结合蛋白2可与SOCS3的CpG岛结合，引起该位点的甲基化，从而减弱SOCS3对Th17细胞分化的抑制作用[12]。(3)Treg在哮喘中能维持免疫平衡、抑制气道炎症反应，Treg的分化依赖于叉头框转录因子P3(fork-head box P3，FOXP3)，暴露于空气污染中的哮喘患者中发现FOXP3 CpG岛的甲基化水平高于普通人群，从而使得Treg数量及功能异常，加重气道炎症反应[13]。

1.2 介导气道炎症

Th2细胞通过分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子，诱导IgE合成、嗜酸粒细胞聚集及活化，参与Th2型哮喘炎症反应；Th17细胞主要通过分泌IL-17，介导重症哮喘气道中性粒细胞浸润。同时有研究发现，与健康者比较，哮喘患者支气管上皮细胞的IL-33及其下游基因CCL26低甲基化也能通过募集嗜酸粒细胞导致哮喘炎症恶化[14]。一氧化氮参与过敏性气道炎症的病理生理过程，呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，FeNO)是反映气道炎症的指标。Breton等[15]研究发现，哮喘患儿中FeNO的表达水平高，并在炎症反应及氧化应激途径被激活的背景下，精氨酸酶基因的DNA甲基化与FeNO的产生呈负相关；另外IL-6、诱导型一氧化氮合酶的低甲基化，也被证实能调节FeNO水平，参与气道炎症[16]。载脂蛋白A-1是高密度脂蛋白的主要结构蛋白，除了能保护心血管外，也可能与哮喘中性粒细胞气道炎症的发生及其严重程度相关[17]。Stefanowicz等[18]在哮喘患者中发现载脂蛋白A-1基因存在甲基化改变，并提出这种现象可能与气道炎症相关。类黏蛋白1样蛋白3基因是一种哮喘易感基因，与正常人相比，哮喘患者外周血单核细胞高表达的类黏蛋白1样蛋白3能诱导IL-6和IL-8的产生，同时激活p-ERK/MMP-9通路，参与气道炎症及重塑，并且其高表达受DNA甲基化调控[19]。

1.3 参与气道重塑及气道高反应性

比较经典的是磷酸二酯酶4D，哮喘患者气道平滑肌细胞的磷酸二酯酶4D低甲基化，能促进平滑肌细胞的增殖、迁移及收缩，增加气道高反应性的同时参与气道重塑的过程[20]。Shang等[21]在屋尘螨诱导的哮喘小鼠中，发现钠钙交换体slc8a3的启动子区域高甲基化，可能通过改变小鼠肺及气道的Na＋-Ca2＋转运，增加气道高反应性。哮喘儿童中调节气道平滑肌紧张性的β2肾上腺素能受体基因的高水平甲基化，也被证实参与气道高反应性并与哮喘的严重程度相关[22]。

2 组蛋白甲基化修饰

组蛋白甲基化是指组蛋白H3和H4的N末端氨基酸残基上发生的甲基化修饰，由含SET结构域的组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶催化，同样可导致转录的激活或抑制。其功能依赖于被修饰的氨基酸残基类型、组蛋白甲基化形式和甲基化位点。常见被修饰的氨基酸残基包括精氨酸和赖氨酸，精氨酸有单甲基化和双甲基化2种形式，主要与基因的激活相关；赖氨酸则有单甲基化、双甲基化、三甲基化3种状态，功能较复杂，通常H3K4、H3K36、H3K79位点的甲基化促使基因活化，提高其转录作用，H3K9、H3K27、H4K20的甲基化则使得转录被抑制[23]。哮喘中常见的组蛋白赖氨酸甲基化位点有H3K4、H3K9和H3K27，也能通过不同机制参与哮喘发病。

2.1 H3K4

Seumois等[24]发现，哮喘中Th2相关细胞因子基因座中H3K4甲基化增强子明显富集，其中哮喘相关基因(包括CCR4及CCL5)启动子及顺式调控区域内H3K4me2的富集增加也可被视为Th2细胞分化的标志。

2.2 H3K9

G9a是参与H3K9甲基化的重要甲基化转移酶，同样在T细胞分化和功能中起重要作用。研究发现在寄生虫介导的过敏性炎症反应中，G9a诱导的H3K9me2促进Th2细胞分化并抑制IL-17A的表达[25]，但是关于G9a是否在哮喘中也能对T细胞分化进行调节，仍需进一步研究。血管内皮生长因子与气道重塑密切相关，哮喘患者气道平滑肌分泌的血管内皮生长因子较正常人多，与G9a的募集失败，阻碍血管内皮生长因子启动子区的H3K9me3，进而抑制H3K9me3通过调节Sp1及RNA聚合酶Ⅱ的结合来抑制血管内皮生长因子转录的能力相关[26]。整合素-金属蛋白酶33(a defibrinogen and metalloprotease 33，ADAM33)是第一个通过克隆定位被发现的哮喘易感基因，与气道高反应性及气道重塑相关[27]，哮喘中该基因的表达也受表观遗传学调控，除了被DNA甲基化修饰外，有研究证实转化生长因子β2可以促使ADAM33启动子上的组蛋白H3的脱乙酰化、H3K4的去甲基化和H3K9的高甲基化，进而下调ADAM33 mRNA表达，这可能是哮喘中存在的一种稳态平衡调节机制[28]。

2.3 H3K27

屋尘螨诱导哮喘小鼠的肺组织中，发现H3K27的去甲基化，与正常平滑肌细胞向合成/增殖型及收缩型气道平滑肌细胞转化相关，在给予GSK-J4抑制H3K27的去甲基化酶活性后，可明显减轻哮喘的气道高反应性及气道重塑，同时也能减轻气道炎症[29]。Zeste同源蛋白2增强子(enhancer of zeste homolog 2，Ezh2)是参与H3K27me3的一种组蛋白甲基转移酶，与基因抑制相关，通过调节Tbx21(T-bet)和GATA3的H3K27me3参与CD4＋T细胞分化，哮喘中Ezh2的缺失能增强Th2细胞因子的聚集、增加IgE的水平，从而加重气道炎症反应[30]，同时Ezh2作为恒定自然杀伤细胞致病性的重要调节因子，能抑制恒定自然杀伤细胞诱导小鼠自发性哮喘样疾病发生的能力[31]。

2.4 组蛋白精氨酸甲基化

除了组蛋白赖氨酸甲基化外，组蛋白精氨酸甲基化修饰也参与哮喘的发病。重症哮喘的肺组织及气道平滑肌细胞中发现Ⅰ型组蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase 1，PRMT1)高表达，PRMT1是PRMTs家族中最常见的一种，其主要修饰位点是组蛋白H4的第3位精氨酸残基(H4R3)，通常能正向调控基因的表达。PRMT1与Ⅰ型胶原和纤维粘连蛋白沉积、细胞增殖和气道平滑肌细胞迁移相关，是参与哮喘气道重塑的重要靶点[32,33]，同时也有研究证实PRMT1参与气道炎症反应[34]。

3 RNA甲基化

除了DNA甲基化及组蛋白甲基化，还有一种甲基化方式为RNA甲基化，RNA是DNA及蛋白质在生命活动中的纽带，细胞内的RNA有多种修饰方式，其中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)修饰是哺乳动物信使和非编码RNA中最普遍和可逆的内部修饰，在肿瘤性疾病中有较多研究。m6A是指发生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰，由甲基转移酶复合体(METTL3、WTAP、METTL14)、去甲基酶(FTO、ALKBH5)、相应的阅读蛋白(YTHDF、YTHDC)等协同调控，主要在终止密码子和3′非翻译区附近富集，以不依赖帽的方式翻译，参与RNA生命周期的各阶段，如转录、加工、翻译和代谢[35]。m6A修饰除具有调节癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力外，已有研究证实其也能影响CD4＋T细胞分化、参与免疫及炎症反应的调节。目前关于m6A修饰与气道炎性疾病的研究较少，就已有研究来看，暗示其与哮喘的发病可能存在关联，以下就m6A修饰可能参与哮喘发病的机制作一总结。

如前所述，CD4＋T淋巴细胞在哮喘中发挥重要的作用，m6A参与T细胞分化及稳态的调节。Li等[36]的研究证实，m6A通过靶向SOCS蛋白家族，调控IL-7及TCR信号通路，进而影响T细胞稳态增殖及分化，并且在抑制METTL3表达后，Th1及Th17细胞比例显著减少，Th2增加，但Treg比例无明显变化。同时Tong等[37]的研究指出，METTL3的缺失所致m6A修饰的减少，使SOCS水平增加，通过抑制IL-2/信号转导与转录激活因子5a(signal transducer and activator of transcription 5a，STAT5a)通路影响Treg的功能及稳定性。树突状细胞作为一种抗原递呈细胞，在过敏原刺激下，也能促进哮喘中CD4＋T细胞分化为Th2细胞，在气道炎症的形成及慢性炎症的维持方面发挥重要的作用。研究发现m6A修饰能通过上调树突状细胞中关键转录物(包括CD40、CD80和TLR信号适配蛋白Tirap)的表达水平来促进树突状细胞的成熟和激活，进一步促进CD4＋T细胞增殖和促炎细胞因子的分泌[38]。除了可能通过影响CD4＋T细胞分化参与哮喘发病外，m6A也可能通过影响巨噬细胞的极化，参与气道炎症反应。哮喘是一种多炎症细胞参与的气道疾病，其中巨噬细胞不同的极化状态也被证实参与哮喘的病理过程。巨噬细胞分为M1及M2型，M1型可以通过分泌IL-1β及IL-23等细胞因子，引起Th1及Th17样反应，促进中性粒细胞的聚集及急性气道高反应性的发生，并可能在激素抵抗性哮喘中发挥重要作用[39,40]，提示M1型巨噬细胞主要可能在非Th2型哮喘中发挥作用。而在Th2型哮喘中，M2型巨噬细胞数量增加，能趋化嗜酸粒细胞在气道浸润的同时也参与气道重塑。Liu等[41]研究发现，METTL3介导的m6A修饰能增加STAT1 mRNA的稳定性并上调STAT1的表达水平，随后驱动巨噬细胞向M1型极化，促进炎症反应的发生。

4 针对甲基化修饰的治疗

目前临床上对中、重度哮喘的主要用药为吸入性糖皮质激素及长效β2受体激动剂，研究发现长效β2受体激动剂也能通过抑制H3K4的甲基化，减少Th2细胞相关细胞因子的产生，在扩张支气管的同时发挥抗炎作用[42]。另外过敏原的特异性免疫治疗，也是一种高效的治疗儿童哮喘的方法，有研究表明特异性免疫治疗能降低IL-2、IL-4、IL-5等细胞因子的表达水平，同时也能增加IL-4启动子的DNA甲基化，来阻止致敏反应的发生[43]。近年来对于常规治疗方案不敏感的患者，有一些潜在的表观遗传治疗方法，如DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂脱氧胞苷，其在实体肿瘤及骨髓增生异常综合征中已有应用，能通过上调哮喘小鼠FOXP3表达水平，增加Treg数量[44]；也能通过逆转哮喘中γ干扰素高甲基化、阻止Th2极化[5]，减轻哮喘小鼠气道炎症及高反应性；另外，5-氮杂脱氧胞苷也被证实可以抑制血小板衍生生长因子诱导的气道平滑肌细胞表型向增殖、迁移、收缩型转变，可能在抑制气道重塑方面起作用[45]。还有如前所述的一些靶向组蛋白甲基化修饰酶的制剂，也为哮喘的表观遗传学治疗提供可行性。但目前尚缺乏实际应用于临床治疗哮喘的该类药物，需要更多的研究去探讨其临床价值。除了化学药物治疗外，环境及饮食等因素也能通过改变不同的甲基化修饰，参与哮喘发病。因此改善环境或者调整饮食结构，也可能通过改变哮喘中可逆的表观遗传修饰，使哮喘症状得到一定缓解[46]。

5 总结与展望

哮喘是一种复杂的气道异质性疾病，遗传、环境、免疫等多重因素相互作用，共同参与其发病，表观遗传学则在其中起着桥梁的作用。从发病机制看，DNA及组蛋白甲基化，可通过影响CD4＋T细胞的分化、诱导气道炎症反应、气道重塑及气道高反应性的发生，参与哮喘发病，除此之外，由于m6A修饰能调节免疫及炎症反应，我们猜测RNA甲基化修饰可能也参与哮喘的发生、发展，但需要更多的证据去证实。从治疗方面看，可逆的表观遗传学修饰，为如今那些对激素不敏感的哮喘患者的治疗提供了可行性，从表观遗传学的角度出发，可能为哮喘特异性治疗开辟更多新的途径。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献略